элементов с известными функциями. Хорошим примером тому являются гены, кодирующие белки, необходимые для чувства обоняния. У позвоночных белки, называемые обонятельными рецепторами, обеспечивают чувство запаха. У млекопитающих гены, кодирующие обонятельные рецепторы, представлены большим семейством. Очень мало белков, кодируемых этими генами, были изучены в лабораторных экспериментах. Однако ученые знают, что гены этого семейства кодируют именно обонятельные рецепторы, поскольку у них есть общие последовательности ДНК. Поскольку объем баз данных последовательностей ДНК продолжает расти, то увеличиваются и возможности установления их функциональной значимости путем сравнения с соответствующими последовательностями в генах с известными функциями.
Клонирование генов
Сравнительно недавно появилась технология, позволяющая изолировать и изучать отдельные гены, которая называется «клонирование генов». Обычно ее используют для выделения отдельных генов, чтобы исследовать их свойства и функции. Кроме того, с помощью этого метода можно создать мутации в отдельных участках генов, чтобы определить, как может быть изменена их работа.
Клонировать гены в таких организмах, как бактерии, сравнительно просто. Давайте рассмотрим репарацию дефектной ДНК у бактерий. Из-за поврежденной после облучения УФ-светом ДНК бактерии не могут расти, поскольку мутирует ген, необходимый для репарации ДНК (такие бактерии мы называем бактериями с мутированным фенотипом). Можно создать библиотеки бактериальных ДНК, в которых отдельные бактерии содержат разные части бактериальной ДНК, присоединенные к другой ДНК, называемой плазмидной ДНК. Это соединение достигается с помощью ферментов, которые «вырезают и вставляют» ДНК, и в результате возникает библиотека плазмид, несущих различные части бактериальной ДНК. Плазмиды естественным образом существуют в бактериях, в которых они размножаются. В эксперименте мутантные бактерии, не способные расти при УФ-облучении, заражают плазмид-ной ДНК и подвергают воздействию УФ-излучения. Все бактерии, содержащие плазмиды, несущие гены, необходимые для репарации ДНК, поврежденной УФ, выживут при УФ-облучении. Затем ДНК из колоний этих бактерий можно использовать для извлечения интересующих нас генов.
Подобным образом можно клонировать и гены человека, если использовать те его клетки, биологическая активность которых нарушена, и выделять гены, которые могут быть ответственны за эти нарушения. Когда я руководил лабораторией в Стэнфордском университете, я изучал репарацию ДНК в клетках человека и использовал клетки, не способные к репарации ДНК в результате заболевания под названием «пигментная ксеродерма» (ПК). Люди с ПК из-за мутированных генов (а таких генов несколько) особенно чувствительны к солнечному свету, и у них часто развивается рак кожи. Нам с коллегами удалось клонировать несколько генов, дефекты в которых приводили к ПК.
Клонированные гены используют не только для изучения их функции. Их можно вводить в бактерии, а белок, который кодируется введенным геном и синтезируется в бактериях, можно таким образом выращивать для коммерции. Например, если у вас есть собственная фирма, то вы можете производить и продавать инсулин человека для лечения диабета. Инсулин – это белок, вырабатываемый клетками поджелудочной железы, без которого человек страдает от диабета.
Подобно процедурам, которые я описал для клонирования генов, необходимых для репарации ДНК, можно клонировать и ген инсулина человека (предварительно выделить его или купить), вставив в плазмиду. Когда вы инфицируете бактерии такой рекомбинантной плазмидной ДНК, создаются миллиарды копий плазмидной ДНК, которая производит инсулин человека. Если эти манипуляции производить в промышленном масштабе, можно получить килограммы бактерий, несущих плазмиды. После переработки бактерий у вас будет экстракт, из которого можно выделить чистый инсулин.
Технология рекомбинантных ДНК (генная инженерия)
Если клонирование относится к выделению интересующего нас гена из генома организма, то технология рекомбинантных ДНК, которую часто называют генной инженерией, подразумевает введение клонированных генов в геном другого организма.
В 1972 году Пол Берг в Стэнфордском университете создал первые рекомбинантные молекулы ДНК, соединив ДНК вируса SV40 обезьяны с бактериофагом, который инфицирует бактерию E. coli (кишечную палочку). Берг собирался ввести эту рекомбинантную ДНК в лабораторный штамм E. coli. Однако он не осуществил свой план, поскольку ученые взволновались в связи с потенциальной биологической опасностью этой процедуры. В частности потому, что вирус SV40 вызывает рак у мышей. Кроме того, кишечная палочка (хотя и не тот штамм, что использовал Берг) есть и в кишечнике человека. Поэтому возникло опасение, что ДНК, содержащая вирус SV40, попадет в окружающую среду, заразит сотрудников лаборатории (и других) и они станут жертвами рака.
Впоследствии Герберт Бойер в Университете Калифорнии в Сан-Франциско и Стэнли Коэн в Стэнфорде создали первый трансгенный организм, вставив гены, резистентные к антибиотикам, в плазмиду E. coli. А Рудольф Йениш в Массачусетском институте технологии создал трансгенную мышь, введя чужую ДНК в ее эмбрион и получив первое в мире трансгенное животное.
Потенциальные риски генной инженерии и ее достижений вызвали страхи у научного сообщества. Это была технология, благодаря которой любой участок ДНК можно теоретически ввести в бактерию, например E. coli, а она, в свою очередь, может заразить людей. Именно это волновало научное сообщество, поскольку вирус SV40 может трансформировать клетки обезьяны и человека в раковые.
Эти соображения подтолкнули Берга в 1975 году созвать в Асиломаре в штате Калифорния научную конференцию. Состоялась продолжительная дискуссия на тему безопасности этой технологии. Впоследствии во всем мире были приняты правила производства, хранения и работы с продуктами рекомбинантных ДНК. В момент написания этих строк еще не было зарегистрировано ни одного случая претворения в жизнь страшного сценария биокатастрофы в результате вышедшей из-под контроля и сбежавшей из лаборатории опасной ДНК.
ДНК-фингерпринтинг
ДНК-фингерпринтинг, называемый также ДНК-печатанием, ДНК-профилированием, генетическим дактилоскопированием, генотипированием или идентификацией личности, – это метод идентификации элементов в последовательности ДНК, которые уникальны для каждого человека, как и отпечатки пальцев (отсюда и термин «фингерпринтинг», или дактилоскопия). Этот метод разработал в 1984 году британский генетик Алек Джеффрис (ныне Сэр Алек Джеффрис), который проводил исследования в Лестерском университете и заметил, что некоторые последовательности высоковариабельной ДНК (известные как микросателлиты), не имеющие функционального значения для гена, внутри гена повторяются. Продолжая исследования, Джеффрис узнал, что у каждого человека есть уникальный набор микросателлитов, за исключением тех, которые появились на свет из одной оплодотворенной яйцеклетки, то есть однояйцовых близнецов.
В недавнем интервью Джеффрис заявил: «Моя жизнь изменилась в понедельник утром 10 сентября в 9 часов 05 минут 1984 года. Появился первый в мире генетический фингерпринт. В науке такие моменты – «эврика» – нечасты. Мы искали чрезвычайно изменчивые паттерны ДНК в разных образцах, взятых в том числе у моей лаборантки и ее родителей, а также не у человека. Первая моя реакция на полученные результаты была такой: все слишком сложно. Но потом последний фрагмент этого пазла встал на место и я понял: теперь у нас есть генетическая
