К большому огорчению Кельнера, он получил результаты, которые было трудно воспроизвести. В результате упорной работы он в конечном итоге определил, что причиной противоречивости его результатов было флюоресцентное освещение в самой лаборатории и установил, что клетки, подверженные УФ-облучению, «поправлялись», если потом их выставляли на видимый свет. Скоро Кельнер понял, что он открыл биологический процесс репарации ДНК. Обрадованный неожиданным открытием Кельнер с разрешения Демереца прекратил поиск новых бактерий, способных производить антибиотики, и сосредоточился на явлении репарации ДНК.

По странному стечению обстоятельств в то время, когда Кельнер пытался разобраться со своими наблюдениями по УФ-облучению бактерий, итальянский ученый Ренато Дульбекко в Университете Индианы проводил эксперименты с воздействием УФ-излучения на бактериофагов. Как и Кельнер, Дульбекко с огорчением заметил, что, когда он складывал стопки агаровых пластин (на которых росли видимые колонии бактерий), количество выживших фагов постоянно значительно менялось. В конце концов он понял, что в агаровых пластинах наверху стопки (то есть подверженных видимому свету) было наибольшее количество фагов, и пришел к выводу, что обнаружил механизм репарации ДНК, связанный с действием света, который он назвал фотореактивацией. Со временем Кельнер и Дульбекко договорились разделить заслугу открытия фото-реактивации и репарации ДНК.

Вскоре произошел сдвиг в понимании ферментной фотореактивации и того, что происходит во время этого способа репарации ДНК. Чтобы понять ферментную фотореактивацию, нам придется вернуться к двум основаниям – тимину (Т) и цитозину (С). Эти два основания относятся к органическим соединениям под названием «пиримидины». Хорошо известно, что, когда ДНК подвергают воздействию УФ, два смежных пиримидина в цепи ДНК могут объединиться и вызвать ее нарушение – образование пиримидиновых димеров (Т-Т), (Т-С) и (С-С). Пиримидиновые димеры изменяют трехмерную структуру ДНК, что приводит к остановке ее репликации ДНК-полимеразой и понижению уровней транскрипции генов РНК-полимеразой. Однако, когда ДНК, содержащая пиримидиновые димеры, подвергается воздействию видимого света, фермент (называемый фотореактивирующим) переводит димеры в нормальные несвязанные основания ТТ, ТС или СС. К сожалению, у млекопитающих фотореактивирующего фермента нет. Будь у наших клеток такой фермент, нам бы не угрожал в такой мере риск получить рак кожи в результате ежедневных солнечных ванн!

Рис. 8.1. Ренато Дульбекко

В последующие годы были открыты другие механизмы репарации ДНК, в том числе эксцизионная репарация – важный процесс восстановления ДНК, который распознает большой спектр поврежденных оснований в ДНК и вырезает поврежденный сегмент (процесс эксцизии) из нити ДНК (рис. 8.2). Это приводит к образованию пробелов в поврежденной цепочке ДНК, заполняемых ДНК-полимеразой, которая использует противоположную нормальную цепочку ДНК как матрицу точно так, как это происходит во время репликации ДНК (рис. 8.2). Процесс эксцизионной репарации не ограничивается удалением тиминовых димеров. Механизм эксцизионной репарации распознает и восстанавливает многочисленные типы повреждения оснований в ДНК. Таким образом, ученые пришли к мнению, что механизм эксцизионной репарации распознает искажение структуры ДНК, общее для многочисленных типов повреждения оснований. Природа этого предполагаемого искажения остается неразгаданной.

Надеюсь, вы помните, что ДНК содержит основание цитозин (С), а РНК – основание урацил (U). Я упоминал ранее, что ученые не понимают, почему это именно так. Представляется следующее разумное объяснение этой странности.

Рис. 8.2. Эксцизионная репарация ДНК

Химические структуры оснований цитозина (С) и урацила (U) очень похожи. Следовательно, цитозин (С)) в ДНК иногда может спонтанно заменяться на урацил (U). Изменение учащается, если клетки подвергаются действию некоторых химических веществ. Томас Линдаль, американский ученый родом из Швеции, открыл механизм репарации ДНК, во время которого (U) в ДНК (но не в РНК) селективно удаляется ферментом репарации и замещается цитозином (С). Однако, если бы в норме в ДНК вместо (С) было (U), стратегия репарации ДНК, которая удаляет U из ДНК, удалила бы U и из неповрежденной ДНК.

* * *

Последний механизм репарации ДНК, о котором я расскажу, – это так называемая репарация ошибочно спаренных оснований. Напомню: во время синтеза новых нитей ДНК ДНК-полимеразой иногда в новую цепочку встраивается не то основание, которое нужно, генерируя ошибочно спаренные основания. Ошибки спаривания можно исправлять с помощью процесса, во время которого ошибочное основание вырезается из ДНК и замещается правильным. Но если предположить, что процесс репарации узнает ошибки спаривания оснований, то неизбежно возникает волнующий вопрос. Поскольку оба основания в неправильной паре химически нормальные, как процесс репарации «понимает», какая из двух цепочек ДНК содержит неправильное основание?

Рис. 8.3. Пол Модрич

Рис. 8.4. Томас Линдаль

Мэтью Мезельсон, ученый из Гарвардского университета, уверенный в том, что существует механизм, отличающий нормальную нить ДНК от вновь синтезированной и содержащей одно ошибочно спаренное основание, разрешил эту головоломку. Он обнаружил, что при копировании ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы для создания новой нити ДНК нить матричной ДНК, которая копируется, временно химически модифицируется, а вновь синтезированная дочерняя нить – нет. Этот нюанс работает как сигнал, который «командует» процессу репарации ошибочно спаренных оснований удалять нуклеотид в немодифицированной цепочке независимо от того, что это за нуклеотид.

Пол Модрич из Университета Дьюка разъяснил подробности биохимического механизма, с помощью которого неправильные основания удаляются во время репарации ошибочно спаренных оснований и замещаются правильными нуклеотидами. В 2015 году Модрич и упомянутый ранее Томас Линдаль получили Нобелевскую премию.

Глава 9

Мутации могут вызвать заболевания

Как вы теперь, надеюсь, понимаете, при синтезе новой ДНК фермент ДНК-полимераза «знает», что основание A всегда должно располагаться напротив T, а C – напротив G. Как уже упоминалось в предыдущей главе, ДНК-полимераза (которая, как и все ферменты, не является совершенной в своей работе) иногда включает неправильный нуклеотид во время синтеза ДНК – к счастью, очень редко. Например, вместо основания А напротив Т в растущую цепь ДНК может быть включено неправильное основание С, или G, или даже еще одно Т. Неправильные или невосстановленные основания в генах могут привести к мутациям, которые нарушат нормальную функцию генов, а это иногда может стать причиной серьезных заболеваний, таких как рак.

Оказывает ли мутация в гене пагубное влияние на человека или нет, зависит от того, как она влияет на ген. Если мутация произошла в той области гена, которая несущественна для его функционирования, то она может не иметь явных последствий (это так называемые молчащие мутации). Если мутированный ген замедляет биохимическую реакцию, то это вызовет лишь незначительное нарушение функции генов.

Мутации в генах (за исключением генов в половых клетках) называются приобретенными и могут нарушать